Эмбриональный морфогенез кишечных ворсинок просмотры в e-library

Человек — сложнейшая система, отдельные части которой находятся в постоянном взаимодействии между собой и окружающей средой. Каждый орган, ткань, клетка выполняют свою строго определенную функцию, что делает наш организм максимально устойчивым к внешним раздражителям. Как это стало возможным, как наш организм развивался со временем, чтобы стать таким совершенным, изучает отдельный раздел генетики под названием «морфогенетика».

Что такое морфогенез?

Морфогенез — это последовательность определенных этапов, которые проходит в своем развитии отдельный орган или система органов. Она включает в себя два основных подвида: онтогенез (индивидуальное развитие органов и систем в пределах одного организма) и филогенез (эволюционное, или историческое, развитие систем и отдельных органов).

В основном в изучении морфогенеза человека принимает участие генетика. Но есть и другие науки, которые также вносят вклад в накопление знаний о развитии органов человека:

• молекулярная биология;
• физиология;
• биохимия;
• сравнительная анатомия;
• палеонтология;
• теория эволюции.

Особенности и история

Онтогенез характеризует собой развитие тканей, органов и систем в эмбриональный период развития. Помимо зрелого человеческого организма, процесс морфогенеза может также происходить в культурах клеток и новообразованиях. Также данный процесс происходит у неклеточных форм, хотя у них и отсутствует эмбриональная стадия.

Впервые предположения о формировании органов и о том, как условия внешней и внутренней среды могут на него повлиять, были высказаны в 1952 году Аланом Тьюрингом в его работе под названием «Химические основы морфогенеза». В этой работе был описан математический базис самоорганизации клеток и тканей.

Однако знания о морфогенезе значительно увеличились при открытии ДНК и ее структуры, развитии таких наук, как молекулярная биология и биохимия. Немаловажным стало открытие молекулярных механизмов работы генов.

Основные процессы

В эмбриогенезе, то есть внутриутробном развитии, выделяют следующие основные процессы морфогенеза:

• Клеточное размножение — увеличение их количества, при котором набор хромосом должен быть строго распределен среди последующих клеток, иначе могут произойти аномалии развития. Это возможно путем двух процессов: дробления и митоза.
• Детерминация — означает, что развитие каждой клетки предопределено. Какие-то из них могут быть только половыми, другие — лишь эпителиальными, третьи — нервными и т.д.
• Дифференциация — клетка становится более специфической и выполняет строго предназначенную ей функцию.
• Индукция — одни клетки способны влиять на развитие других. Таким образом, наличие индукции способно активировать процесс дифференциации благодаря наличию специальных факторов регуляции морфогенеза.
• Интеграция — объединение структур, занимающих более низкую нишу эмбриогенеза, в более сложные. Например, клетки образуют ткани. Ткани — органы. Органы — системы.
• Адгезия — способность клеток образовывать контакты для обмена информацией
• Миграция клеток — способность клеток перемещаться в пределах эмбриона.
• Апоптоз — запрограммированная гибель клетки.

Основные уровни

Морфогенез — это сложная, высокоточная система, которая происходит на многих уровнях организма. Условно выделяют два основных уровня регуляции развития всего организма:

Молекулярный уровень

Структуры, которые имеют возможность влиять на морфогенез, получили название морфогенов. Их подразделяют на следующие классы:

• Факторы транскрипции — могут взаимодействовать с ДНК, имеют способность регулировать экспрессию генов через катализацию, то есть ускорение, их транскрипции.
• Структуры, способные регулировать межклеточные контакты. К примеру, на одном из этапов внутриутробного развития, гаструляции, клетки теряют связь друг с другом, мигрируют в новое место, где вновь обретают способность образовывать новые контакты.

Клеточный уровень

Что он собой представляет? Морфогенез — это последовательность реакций, которые невозможны без постоянного взаимодействия клеток друг с другом. Ниша стволовой клетки — это именно то связующее звено между одной клеткой и всем организмом. Существуют такие типы клеток, как эпителиальные и мезенхимальные. В процессе эмбриогенеза они могут переходить друг в друга. Вследствие такого процесса как клеточная дифференциация. При этом возможно также их перемещение из одного места в эмбрионе в другое.

Этапы развития организма

Человеческий организм в своем развитии проходит определенные этапы. И хотя морфогенез — это механизм, который наибольшее свое значение обретает на этапе внутриутробного развития, и после рождения наши органы меняются вплоть до самой смерти. Множество патологий развития органов происходят именно в эмбриональном периоде. Однако стоит выделить и другие стадии морфогенеза:

1. Пренатальный — тот самый внутриутробный, от зачатия и до родов. Он делится, в свою очередь, на эмбриональный и фетальный периоды. Их сроки: 8 недель после зачатия и после окончания эмбрионального периода до родов соответственно.
2. Перинатальный — период с 22 недель внутриутробного развития до 7 первых дней жизни.
3. Интернатальный — период всей родовой деятельности.
4. Неонатальный — первые 28 дней жизни.
5. Постнатальный — 15 лет после рождения.

Прогенез, фетогенез, киматогенез: что это такое?

Однако можно выделить еще один период, который начался еще до зачатия — это прогенез. Это этап, который подразумевает под собой закладку половых клеток в организме будущих родителей. Именно прогенез можно назвать этапом начала морфогенеза.

Отдельно также выделяют такой период, как фетогенез. В нем есть еще два периода:

• ранний фетальный — с 76 по 180 день беременности;
• поздний фетальный — с 181 по 280 день беременности.

Киматогенез, в свою очередь, включает все перечисленные выше процессы: эмбриогенез, прогенез и фетогенез. А изучает его отдельная наука, которая получила название «киматология». Изучением развития эмбриона и плода занимается эмбриология.

Филогенез

Выше подробно была рассмотрена такая часть морфогенеза как онтогенез. Однако стоит уделить внимание также филогенезу — развитию отдельных видов в процессе эволюции. Как и в онтогенезе, в филогенезе также есть свои принципы, на которых он построен:

• Дифференциация — в процессе формирования организма определенная часть клеток становится обособленной, обретая собственные функции и уникальное строение. Эта совокупность клеток образует отдельную ткань или орган.
• Интеграция — укрепление связей между отдельными клетками и целыми системами органов.
• Каждый орган имеет как основную функцию, так и множество второстепенных, которые дают возможность преобразовываться и адаптироваться к новым условиям.
• Основная функция может как утрачиваться, так и обретать большее значение в зависимости от новых условий.
• Развитие органов может быть как в сторону большего совершенствования и усложнения, то есть прогрессирования, так и в сторону упрощения (регрессирования).
• Корреляция — все части организма находятся в тесной взаимосвязи друг с другом, изменение одной его части несет за собой изменение всего организма.

Читайте также:  Опоясывающая боль вокруг живота и спины

Таким образом, морфогенез и его биологическая сущность крайне комплексны и сложны. Постоянное взаимодействие отдельных этапов индивидуального и эволюционного развития организма обеспечивают возможность к его существованию в постоянно меняющейся внешней среде.

With the high prevalence of gastrointestinal disorders, there is great interest in establishingin vitro models of human intestinal disease and in developing drug-screening platforms that more accurately represent the complex physiology of the intestine. We will review how recent advances in developmental and stem cell biology have made it possible to generate complex, three-dimensional, human intestinal tissues in vitro through directed differentiation of human pluripotent stem cells. These are currently being used to study human development, genetic forms of disease, intestinal pathogens, metabolic disease and cancer.

Здесь мы обсудим современное понимание развития кишечника и как эта информнация может быть использована для управления дифференцировкой человеческих плюрипотентных стволовых клеток (PSCs) в ткани кишечника in vitro/ Этот подход требует определенных по времени манипуляций с сигнальными путями пошаговым способом, которые воспроизводят раннее развитие кишечника (Fig. 1). Эти основные ступени развития включают формирование дефинитивной энтодермы, формирование паттерна задней части энтодермы, образование кишечной трубки и рост и морфогенез кишечника (Fig. 2). Успехи в этой области в основном обусловлены переходом с двухмерных к трехмерным условиям роста и присутствием мезенхимных типов клеток, это усложняет тканевой уровень и лучше всего напоминает развитие кишечника in vivo. Fig. 1. Fig. 2.

Получение кишечных клеток из PSCs нуждается в ступени, воспроизводящей процесс гаструляции и формирование дефинитивной энтодермы (DE) (Fig. 1). Исследования гаструляции с использованием эмбрионов рыб, кур и мышей оказались существенными в идентификации консервативных молекулярных путей, управляющих гаструляцией клеток в энтодермальный и мезодермальный клоны (rev. Zorn and Wells, 2009; Zorn and Wells, 2007). Центральным в этих процессах является Nodal семейство TGFβ сигнальных белков, которые у эмбрионов лягушек действуют, чтобы инициировать гаструляцию и управлять спецификацией клонов мезодермы и энтодермы зависимым от дозы способом (Green and Smith, 1990). Nodal действует посредством своих родственных Type I (Alk4/7) и type II (ActRIIA or B) рецепторов и также нуждается в корецепторе Crypto для сильной активации передачи сигналовin vivo (Gritsman et al., 1999). Активность серин-треониновой киназы Nodal-рецепторного комплекса обеспечивает фосфорилирование и локализацию в ядре комплекса Smad2/3/4. Оказавшись в ядре, Smads взаимодействуют с транскрипционными кофакторами, таким как FoxH1/FAST1 или Mix-подобными гомеодоменовыми белками, чтобы активировать высоко конервативную сеть энтодермальных регуляторных генов (Hoodless et al., 2001; Tremblay et al., 2000). Стержневыми в этой транскрипционной сети у позвоночных являются транскрипционные факторы Sox17, Foxa2, Mix, Gata4/6 и Eomes. Хотя точная роль этих факторов может слегка варьировать среди позвоночных, они действуют скоординировано в индукции энтодермального клона (Sinner et al., 2006).

Исследования in vitro и in vivo подтвердили, что передача сигналов Wnt обеспечивает приобретение задней кишки, регулируя экспрессию Cdx2 . Напр., электропортация постоянно активной формы β-catenin в энтодерме передней кишки мыши, генетическая активация β-catenin или стабилизация β-catenin с использованием Gsk3b ингибитора на ст. E8.25 приводит к эктопической индукции Cdx2 и к репрессии Sox2 в передней кишке (Sherwood et al., 2011). Пути передачи сигналов Fgf, RA и BMP сходным образом регулируют спецификацию задней энтодермы путем регуляции экспрессии генов Cdx (Bayha et al., 2009; Dale et al., 1992; Dessimoz et al., 2006; Keenan et al., 2006; Kinkel et al., 2008; Kumar et al., 2003; Lickert and Kemler, 2002; Northrop and Kimelman, 1994). Во многих случаях, эти пути непосредственно регулируют экспрессию Cdx посредством элементов, чувствительных к Wnt, RA и Fgf (Haremaki et al., 2003; Rankin et al., 2011; Tiso et al., 2002). Наконец, Cdx факторы воздействуют обратным образом на эти пути постериоризации путем регуляции экспрессии ключевых сигнальных компонентов, таких как Wnt3, Fgf8 и RA синтезирующий фермент Cyp26a1. Эти данные подтверждают, что имеется задняя регуляторная сеть, использующая синергичные активности Fgf, Wnt и RA, которые действуют, чтобы регулировать экспрессию семейство Cdx транскрипционных факторов.

Манипуляции с задней регуляторной сетью были сфокусированы на усилиях управлять дифференцировкой кишечника, происходящего из PSC DE мыши и человека (Ameri et al., 2009; Cao et al., 2010; McCracken et al., 2011; Ogaki et al., 2013; Sherwood et al., 2011; Spence et al., 2011b; Ueda et al., 2010). Активация пути Wnt в культурах DE, произошедших ESCs мыши управляет приобретением задней судьбы, как это показано с помощью экспрессии Cdx2 . Однако, Cao с коллегами сообщили, что экспрессия Cdx2 нуждается в присутствии среды, кондиционированной фибробластами (Cao et al., 2010), подтвердив, что др. сигнальные факторы, секретируемые фибробластами, действуют совместно с Wnt, чтобы обеспечивать заднюю спецификацию. В самом деле, пути WNT и FGF, как было установлено, действуют синергично, чтобы индуцировать заднюю судьбу в культуре PSC человека, маркированную широкой экспрессией CDX2 (Fig. 1B) (McCracken et al., 2011; Spence et al., 2011b). Более того, эти исследования продемонстрировали, что имеется потребность в своевременной передаче сигналов, так как пролонгированная совместная активация путей передачи сигналов FGF и WNT необходима, чтобы необратимо специфицировать заднюю судьбу. Напр., продолжительная обработка культур DE человека с помощью FGF4 и WNT3A белков в течение 4-х дней оказалась необходимой для стабильной и необратимой экспрессии CDX2 и была критической для спецификации кишечника. Напротив, более короткое воздействие в течение 2-х дней приводило к временной обратимой индукции CDX2 и было недостаточным для спецификации кишечника (Spence et al., 2011b). Как обсуждалось выше пути WNT и FGF могут иметь множественные узлы пересечения с передачей сигналов RA и BMP во время становления задней оси эмбриона. Т.о., разумно ожидать комбинаторной роли этих путей в активации задней регуляторной сети в культурах PSC; однако это пока не продемонстрировано.

Происходящие из эктодермы ткани также являются критическими для развития и функционирования кишечника. Внутри кишечной мезодермы имеются два нервных сплетения, контролирующих подвижность кишечника. Эти нейроны коллективно названы энтерической нервной системой (ENS), они контролируют мышечные сокращения перистальтики, которые контролируют перемешивание пищи с переваривающими ферментами и перемещение содержимого просвета по GI тракту. Периферическая нервная система происходит из субнабора клеток нервного гребня туловища (NCCs), обозначаемых как вагусные клетки нервного гребня, происходящие непосредственно каудальнее заднего мозга в регионе между сомитами 1 и 7 (Burns et al., 2002; Durbec et al., 1996). Вагусные NCCs мигрируют вентрально и проникают в мезенхиму, окружающую примитивную кишечную трубку на ранних сомитных стадиях у эмбрионов (rev. Kuo and Erickson, 2010). NCCs мигрируют каудально, чтобы колонизировать развивающийся тонкий и толстый кишечник, а миграция регулируется несколькими путями, включая передачу сигналов netrin, Bmp и endothelin (Goldstein et al., 2005; Jiang et al., 2003; Nataf et al., 1996). Наконец, NCCs дифференцируются в нейрональные и глиальные клоны для этого используется репрессия нескольких сигнальных путей, включая Bmp и Notch (Chalazonitis et al., 2004; Goldstein et al., 2005).

Читайте также:  Лекарственные травы для кишечника и желудка

Мультиклональные вклады и межтканевые взаимодействия являются критическими для развития функционального кишечника. Возникла концепция, что одной из причин отсутствия функциональности многих клеток, происходящих из PSC, и тканей является отсутствие органного морфогенеза в культуре монослоя PSC. Напр., монослойная культура, дающая панкреатические эндокринные клетки, лишенные способности секретировать инсулин в ответ на глюкозу (D’Amour et al., 2006) и печеночные гепатоциты, имеющие профиль экспрессии энзимов, являющийся фетальным по природе (DeLaForest et al., 2011). Эти не физиологические двухмерные, (2D) монослойные культуры не могут воспроизвести многие морфогенетические процессы, происходящие во время развития энтодермы в органе. Попытки использовать почти трехмерные (3D) подходы для дифференцировки PSCs в основном применяли спонтанные агрегации в эмбриоидных телах. Однако стохастическая природа этого подхода делает его мало эффективным для управления дифференцировкой в специфические клетки и типы тканей. Более того, мало доказательств, что нормальный морфогенез происходит в эмбриоидных телах. Мы должны обсудить морфогенетические процессы, важные для развития кишечника и как они были использованы для управления морфогенезом PSCs в сложных, 3D кишечных ‘органоидах’ человека (HIOs; see Box 1).

Box 1. PSC-derived versus primary intestinal epithelial cultures: what is the difference? One of the major advances in gastrointestinal biology includes long-term growth and expansion of individual adult ISCs in three-dimensional ‘enteroid’ cultures (Ootani et al., 2009; Sato et al., 2009; Sato and Clevers, 2013; Sato et al., 2011). Enteroids are also commonly referred to as ‘mini-guts’, as well as ‘organoids’ (Sato and Clevers, 2013). Human intestinal organoids (HIOs), however, are derived from pluripotent stem cells and are significantly different from enteroids, as recently discussed at length (Finkbeiner and Spence, 2013). Briefly, enteroids are derived from fully committed adult intestinal crypts (or single ISCs) that are isolated from human or mouse intestine (Gracz et al., 2013; Wang et al., 2013). Enteroids consist of epithelium only and are biased towards an undifferentiated stem-cell fate due to the culture conditions (Miyoshi et al., 2012). Enteroids have proven to be an unparalleled model in which to study molecular mechanisms by which adult intestinal stem cells are regulated and maintained, and are well suited to adult disease studies (de Lau et al., 2011; Dekkers et al., 2013;Zhou et al., 2013). HIOs, however, are generated by recapitulation of a developmental program and are therefore an unparalleled model in which to study human gastrointestinal development (Du et al., 2012). Both HIOs and adult enteroids have great potential as new in vitro models for drug screening, infectious disease and cancer.

Сигнальные пути, контролирующие заднюю судьбу, такие как FGF и WNT, также регулируют поведение клеток энтодермы и мезодермы и участвуют в морфогенеза кишечной трубки. Не каноническая передача сигналов Wnt участвует в морфогенезе и элонгации задней кишки. Мутации в генах, кодирующих или Wnt5a или нижестоящие медиаторы неканонической передачи сигналов Wnt, таких как disheveled-interacting protein Dapper1 (Dact1), нарушают формирование задней кишки и впоследствии удлинение кишечника (Cervantes et al., 2009; Marlow et al., 2004; Rauch et al., 1997; Tai et al., 2009; Yamaguchi et al., 1999). Передача сигналов Fgf может также играть роль в морфогенезе путем регуляции миграции презумптивной мезодермы задней кишки. У эмбрионов кур, Fgf8 и Fgf4 действуют как хемоаттрактант и отталкивающий фактор, соотв., чтобы регулировать миграцию мезодермы латерально и кзади, когда эмбрион и задняя кишка вытягиваются в каудальном направлении (Yang et al., 2002).

В дополнение к кишечному эпителию происходящие из PSC HIOs обнаруживают достоверный уровень мезенхимной сложности. Мезенхима в HIOs происходит из мезодермы, заселяющей ранние DE культуры и увеличивающейся в ответ на FGF4, чтобы сформировать слой примитивной мезодермы, окружающей развивающийся органоид (Spence et al., 2011b) (see Fig. 1). Эти примитивные мезенхимные производные дифференцируются параллельно с эпителием и формируют несколько дифференцированных типов клеток, таких как гладкие мышцы, субэпителиальные миофибробласты и фибробласты, в соответствии с развитием in vivo (Spence et al., 2011b).

Многие из эпителиальных характерных образований, появляющиеся на этой стадии кишечного развития, также возникают и при развитии in vitro кишечника из PSC, т.e. во время формирования HIOs (Fig. 3) (McCracken et al., 2011; Spence et al., 2011b). 3D кубовидный эпителий ранних кишечных органоидов дает псевдослойный эпителий, лежащий в основе воспроизведения морфогенеза ворсинок, за некоторыми исключениями. По мере продолжения роста органоида в культуре, псевдослойный эпителий переходит в столбчатый эпителий; однако, настоящие ворсинки не образуются. Вместо этого образуются похожие на ворсинки структуры, возникающие из эпителиальных выпячиваний, простирающихся в просвет. Эти структуры не являются настоящими ворсинками из-за отсутствия lamina propria, которая лежит в основании мезенхимной ткани, продуцирующей нервные, сосудистые, иммунные и поддерживающие клетки, обычно обнаруживаемые в стержне ворсинки. Хотя настоящие ворсинки не обнаруживаются в развивающихся HIOs, похожие на ворсинки структуры ведут себя подобно их аналогам in vivo и пролиферация ограничивается основанием ворсинко-подобной структуры, как и в домене предшественников между ворсинками и по преимуществу экспрессируют молекулярные маркеры домена меж ворсинками, включая Sox9. Более того, HIOs генерируют клетки, экспрессирующие маркеры для основных типов клеток кишечника: энтероцитов, бокаловидных, энтероэндокринных и Paneth клеток. Совместная экспрессия Gata4/Gata6 и присутствие Paneth клеток в HIOs подтверждают, что эти клетки больше всего похожи на клетки тонкого кишечника. Помимо основных клеточных типов тонкий кишечник in vivo обладает и др. типами клеток, включая tuft, cup и M-клетки; однако. остается неясным обладают ли HIOs этими типами клеток. HIOs также, по-видимому, подвергаются процессам, сходным с образованием крипт. В HIOs, маркер кишечных стволовых клеток Lgr5 не экспрессируется сильно во время ранних стадий развития органоида, но он экспрессируется в дискретных эпителиальных доменах после продолжительного культивирования. Важно подчеркнуть, что функциональная оценка всех типов клеток в органоидах не была проведена и многие из заключений сделаны на анализе маркеров. Следовательно, в этой системе всё более широко д. использоваться дополнительные уровни функциональной оценки индивидуальных типов клеток.

Одной из потенциальных причин отсутствия созревания и/или функциональности является то, что in vitro полученные ткани лишены важных типов клеток, которые являются критическими для функции органа. Напр., даже если HIOs содержат важные типы клеток, произошедшие из мезодермы, которые важны для функции кишечника, такие как гладкомышечные миоциты, фибробласты и субэпителиальные миофибробласты (Powell et al., 2011), они лишены сосудистого сплетения и энтерической нервной системы (ENS), координирующих мышечные сокращения перистальтики. Отсутствие сосудистых и нервных сплетений и делает невозможным изучение нарушений подвижности кишечника. Принимая во внимание существующие протоколы генерации эндотелиальных клеток и NCCs из PSCs человека (Bajpai et al., 2010; Lee et al., 2007; Levenberg et al., 2002), можно будет инкорпорировать сосудистые и ENS предшественники в развивающиеся HIOs в надежде генерировать сосудистые и нервные сети в них. Пример подобного подхода недавно продемонстрирован, причем сосудистые предшественники были добавлены во время дифференцировки из PSCs в предшественники гепатоцитов (Takebe et al., 2013). Добавление сосудистых клеток приводит к образованию 3D печеночных зачатков с хорошо сформированными сосудистыми сплетениями и с улучшенной функциональностью in vivo.

Онтогенез тонкой кишки можно рассматривать как три последовательные фазы: (1) морфогенез и пролиферация клеток; (2) дифференцировка клеток;

(3) клеточное и функциональное созревание.